Топырақтан бөлініп алынған Streptomyces туысы актиномицеттерінің антагонисттік қасиеттерін анықтау әдістері және қажетті материалдар

 Топырақтан бөлініп алынған Streptomyces туысы актиномицеттерінің антагонисттік қасиеттерін анықтау әдістері және қажетті материалдар туралы қазақша реферат

Адам патологиясында бастапқы орынды инфекциялық аурулар алуына байланысты XX ғасырдың соңы мен XXI ғасыр басында медицинаның негізгі мәселелерінің бірі болып жаңа антибиотиктерді, синтетикалық антибактериалды және вирустарға қарсы препараттарды клиникалық қолданысқа енгізу болып саналады. Табиғи немесе синтетикалық жаңа антибиотикалық құрылымдарды ойлап табу осы уақытқа дейін  жалпы антибиотикотерапия әсеріне нашар берілген микроорганизмдердің түрлері мен туыстарының қатысында эффективті әсер көрсететін  жаңа антибиотиктердегі қажеттілікке ғана байланысты емес немесе әлдеқайда жоғары химиотерапиялық индекске ие препараттардың қажеттілігіне байланысты емес – жаңа препараттар статистикалық мәліметтерге сәйкес жоғары эффективтілігін жоғары жылдамдықпен жоғалтатын ескі антибиотикалық препараттарды алмастыру үшін қажет.

Жаңа антибиотиктерді жасау жолдары жаңа табиғи заттардың продуценттерінің скринингімен, қазіргі таңда танымал антибиотикалық құрылымдарының химиялық трансформациясы көмегімен, гендік инженерия әдістерін қолданумен байланысты. Ол үшін келесі шешімдер жүзеге асырылуда: екіншілік метаболиттер ретінде  антибиотик биосинтезіне продуцент геномына егізілген гендер локализациясын зерттеу, генетикалық ақпаратты тасымалдаушы векторларды құру, бөтен гендердің экспрессиясы кезінде клеткаішілік барьерлерді өту жолдарын өңдеу, патоген және адам геномын анықтау, жаңа спецификалық нысана- гендерді іздеу.

Қазақстан Республикасының Білім және Ғылым Министрлігінің қарамағындағы микробиология және вирусология институтының Хасенова А.Х., Треножникова Л.П., Хожамуратова С.Ш.,
Балгимбаева А.С., Рымжанова З.А. деген ғалымдар қатары Оңтүстік Қазақстан облысының топырағынан бөлініп алынған актиномицеттердің антагонистік қасиеттерін зерттеді. Бұл жұмыста Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae 444, Mycobacterium citreum – ға қатысты жоғары белсенділікке ие № 16, 18, 70  штаммдарының антимикробтық қасиеттері зерртелді. Бұл жұмыстың мақсаты — Оңтүстік Қазақстан облысының топырағынан актиномицеттерді бөліп алу және оардың морфологиялық, хемотоксономиялық және антагонистік қасиеттерін зерттеу болып табылады.

Топырақ актиномицеттерін бөліп алу үшін 10-30 см тереңдіктен алынған Оңтүстік Қазақстан облысының лайлары (ил) қолданылды. Селективті фактор ретінде 25 мкг/мл және 50 мкг/мл мөлшерінде сәйкесінше   розеофунгин және канамицин антибиотиктерінің комплексін қоладнылды; бұл оптимальді нұсқа болып есептеледі /5/.

Антагонисттердің біріншілік идентификациясын дақылды-морфологиялық (Гаузе 1 және 2 қоректік орталары), антагонисттік және хемотоксикономиялық қасиеттері бойынша жүргізілді.

Диагностикалық қоректік орталарда ауалы мицелийддің даму дәрежесі, түсі, сипаты белгіленді; субстратты мицелийдің боялу дәрежесі және ерігіш пигменттердің бар болуы немесе болмауы анықталды.  Клетка қабырғасының типін анықтауда қағаз хромотографиясы әдісімен ДАПҚ болуы және формасы (мезо- немесе LL) көмегімен жүргізілді /6/, ал дифференциациялаушы қанттардың құрамы Лешевалье әдісі бойынша бүтін клеткалар гидролизаттарында анықталды.

Біріншілік идентификация нәтижесінде жоғары антагонисттік қасиеті бар актиномицеттер штаммдарын оптимальді өсуін қамтамасыз ететін А4 және 5339 қоректік орталарда  өсірілді. Қоректік орталар құрамы (г/л):

А4 қоректік ортасы: глюкоза — 1; NaCl — 0,5; CaCO₃ — 0,1; соя ұны — 1; рН — 7,2 /7/.

5339 қоректік ортасы: глицерин — 2; соя ұны — 0,5; (NH₄)2SO₄ — 0,15; NaCl — 0,3; CaCO₃ — 0,3; рН стерилизацияға дейін 6,8 /7/.

Споралы материал алу үшін дақылдарды  Гаузе 1 және 2 қоректік орталарында 7-10 тәулік аралығында өсірілді.

Штаммдарды дақылдандыру 100 мл қоректік ортасы бар Эрленмейер колбаларында (750 мл көлемді) жылдамдығы 180-220 айн/мин болатын айналмалы шайқағышта өсірілді (t°C температурасында 4 тәулікте) /8/.

Антибиотик биосинтезі үшін егу материалы ретінде зерттелетін штаммдардың 48-сағаттық дақылдары алынды /9/.

Әр түрлі қоректік орталарда дақылдардың өнімділігін бағалау үшін келесі көрсеткіштер арқылы жүзеге асырылды: биомасса салмағы (г/л), дақылдық сұйықтықтан бутанолды экстракт антибиотикалық активтілігінің мөлшері, ал мицелийден – ацетонды. Сығылған биомасса салмағы өлшеу арқылы анықталды. Агарға диффуздау әдісі көмегімен Гаузе 2 қоректік ортасында антибакериалдық белсенділігі байқалды.

Бұл жұмыстың нәтижесінде антагонисттік қасиеттерді зерттеу бойынша дақылды-морфологиялық қасиеттері жағынан қызығушылық тудыратын және активтілігі бойынша айрықша ерекшеленетін  актиномицеттердің 22 штаммы сұрыпталды. Дақылдардың тустық тегін анықтауда маңызды критерий болып саналатын клетка қабырғасының құрамында галактоза, арабиноза, мадуроза және ксилоза сияқты дифференциацияланушы қанттар және 2,6-ДАПҚ  мезо- немесе LL формаларының бар екені анықталды. Сұрыптап алынған штаммдардың арасында клетка қабырғасы I типті дақылдар басым болды, олардың клетка қабырғасының құрамында LL- диаминопимелин қышқылы бар, 8 штамм клетка қабырғасының құрамында мезодиаминопимелин қышқылы, клетка гидролизаттарында арабиноза және ксилоза бар екені анықталды, сәйкесінше, II (D) типті дақылдар. № 18 штаммның клетка қабырғасының құрамында  мезо- және LL-диамнопимелин қыщқылы және галактоза бар екені анықталды, осының негізінде бұл штаммның аралық актиномицеттер тобына жатқызылатын Kitazatosporia туысына жатқызылатыны анықталды. № 23 штамм клетка қабырғасында мезодиамнопимелин қышқылы және мадуроза бар екені анықталды, бұл III (В) типті клетка қабырғасы бар актиномицеттерге тән қасиет.

Белсенді штаммдар актиномицеттердің әр түрлі туысына жататыны анықталды: Streptomyces туысы көбінесе келесі сериялармен көрсетілген — Aureus ( № 7 шт.), Helvolus (№№ 16, 27), Albus (№ 21), Imperfectus (№ 70, 90), Fradiaе (№ 44, 96), Achromogenes (№ 78), Lavendulae-roseus (№ 31), Chromogenes (№ 43). Актиномицеттердің 11 штаммы сирек кездесетіндер қатарында: Actinomadura (№ 23), Actinoplanes (№ 24, 35, 51, 75, 76, 86, 87, 40), Kitazatosporia (№ 18), Streptoverticillium (№ 91) /10/.

№№ 18, 21, 23, 44 актиномицет штаммдары үшін оптимальді орта – А4болса, ал № 16, 31, 70 штаммдары үшін — 5339 қоректік ортасы.

Сұйық орталарда өсіру нәтижесінде Bacillus subtilis-ке айрықша белсенділік көрсеткен —  №№ 21, 23, 35, 44 штаммдары, ал әлсіз белсенділік танытқан —  №№ 31, 40, 43 штаммдары екені анықталды /5/.

Кырғыз Республикасының Ұлттық Ғылымдар Академиясының Биология – Топырақ Институтының Т.Д. Доолоткельдиева, М.У. Конурбаева,  С.Т. Бобушева және Ч.М. Омургазиева ғалымдар қатарымен Ыстықкөл шұңқырының таулы топырақтарына бөлініп алынған Streptomyces туысы штаммдарының антагонисттік және өсустимулдеуші қасиеттері атты зерттеу жұмысы жүргізілді.

Бұл зерттеу жұмысында Streptomyces изоляттарын продуцирлейтін антибиотиктерде маңызды биологиялық қасиеттерді анықтау жүргізіледі, мысалы, өсу стимулдеуші заттарды ортаға бөлу қасиеті. Антагонист-микробтар және өсустимулдеуші микробтарды практикада қолдану мәселесі көптеген сұрақтарды зерттеуді қажет етеді. Бұл, біріншіден, микроорганизм-продуценттердің жекелей түрлерінің биологиялық қасиеттерін  және олармен синтезделетін метаболиттердің табиғатын білу қажет. Сонымен қоса, өсімдіктер үшін токсикалық емес оптимальді дозаларды қарастыру; микробтық препараттарды қолдану формалары және әдістерін білу қажет.

Микроорганизмдермен синтезделетін өсімдіктердің өсуін стимулдеуші заттар алуан түрлі болады. Актиномицеттер алуан түрлі ауыл шаруашылық өсімдіктердің тамырларымен ассоциативті симбиоздың құрылуына ықпал етеді, бұл жерде олар өсу және дамуды стимулдейді;  сонымен қатар, еркін тіршілік ететін түрлер де баршылық, алайда олар да өсімдіктердің өсуі мен дамуын стимулдеуге қатысады. /11/ Бұл зерттеу жұмысының мақсаты жаңа антибиотикалық құрылымдардың продуценттері болып табылатын Streptomyces табиғи изоляттарының өсустимулдеуші қасиеттерін және ауыл шаруашылық дақылдардың өнімділігін жоғарылату үшін айрықша эффективті штаммдарды сұрыптау болып табылады.

Зерттеу жұмысының әдістері және материалдары.Жаңа антибиотикалық қосылыстарды продуцирлеуге арнайы тест-скрининг өткен Streptomyces изоляттары себу алдындағы ауыл шаруашылық дақылдардың тұқымдарын өңдеу кезінде олардың өсустимулдеуші белсенділігін бағалау үшін қолданылды. Бұл жұмыста келесі сорттар қолданылды: бидай – “Интенсивный”, асбұршақ  — “Цыганка”, соя –“Лопатка”, қияр – “Парад”. Себу алдында тұқымдарды өңдеу үшін стрептомицеттердің алуан түрлі штаммдарының 5-6 тәулік дақылдарының алуан түрлі дозаларын – 10² кл/мл, 10³ кл/мл,10⁴ кл/мл,10⁵ кл/мл және 10⁶ кл/мл.Алдымен, ауыл шаруашылық дақылдардың тұқымдары KMnO₄ әлсіз ерітіндісімен 1 сағат көлемінде дезинфекциялау жүргізілді. Одан кейін дайындалған әрбір дозада тұқымдар ылғалдандырылды. Тұқымдардың экспозициялық уақыты алуан түрлі болды: 3 сағат, 6, 12 және 24 сағат. Бақылауда тұқымдар стерильді суда ылғалдандырылды. Өсустимулдеуші физиологиялық белсенді қосылыстар продуцирлейтін ерекше белсенді продуценттерді зерттеудің бірінші кезеңінде лабораториялық сатысында сұрыптап алынды. Тұқымдар ылғалдандырылған фильтр қағазы бар Петри табақшаларына 20 данадан орналастырылды, 22°С температурада 5 тәулікте өсірілді. Одан кейін өсу стимулдеуші эффект анықталды: тұқымның өнуі, органдардың өсу интенсивтілігі, тамырлардың, сабақтардың қалыптасуы бойынша және биомассаның жалпы салмағы бойынша. Полимеразалы тізбектік реакциясы Gene Amp PCR System 2400 (“Perkin Elmer ”, АҚШ) циклерінде жүргізілді. /6/

Зерттеу жұмысының нәтижелері. Қолданылған Streptomyces туысының 15 штаммының арасында ауылшаруышылық өсімдіктер тұқымдарына және көктеуіне ерекше өсустимулдеуші белседілікке ие тек 2 штамм алынды: gn-2 және mst-8. gn-2 штаммы теңіз деңгейінен 2198 м биіктіктеДжети-Огуз аңғары қара топырағынан бөлініп алынған, ал mst-8 штаммы Ыстықкөл облысыныңтопырағынан бөлініп алынды. Осылайша, бұл сұрыптап алынған 2 штамм 3 қайталамамен табиғи жағдайларға жақын эксперименттерде қолданылды. Тұқымдарды өсіру топырақтың 2 типі қолданылды: таулы қара топырақ және шабындық сұр топырақ. Егу алдында тұқымдарды өңдеу үшін 2 түрлі доза қолданылды: gn-2 штаммы үшін – 10⁴-10⁶ кл/мл, ал mst-8 штаммы – 10³-10⁵ кл/мл.

1-кесте. Streptomyces туысы штаммдарының ауылшаруышылық өсімдіктер тұқымдарына және көктеуіне (өнуіне) ерекше өсустимулдеуші белсенділік көрсеткіштері

1-кесте-де көрсетілгендей, gn-2 штаммдарының суспензиясын қолдану кезінде бидай тұқымдарының 8 тәулікке өнуі 100%,  арпа дәндері үшін – 95,0%, үрмебұршақ дәндерінің өнуі – 100% құрады. mst-8 штаммдарын қолдану кезінде бидай дәндерінің көктеуі 98%, арпа тұқымдарының өнуі 97%, бақылауда — 77%, ал үрмебұршақ тұқымдарының өнуі 98%, бақылауда – 82% құрады.