МКА биологияда, мал дәргерлік және медицна ғылымдарында өте сезімтал анализ (талдау) жасауға баға жеткізсіз көмек көрсетеді. Қазіргі таңда Моноклоналды антиденелерді қолдана отырыа, көптеген адам мен малдардың аса қауіпті жұқпалы ауыруларын анықтауға арналған тиімді, сезімталдығы жоғары дагностикалық тәсілдер ұсынылып отыр. Айталық, бруцеллез, туберкулез, құс тұмауы, африкалық шошқа обасы және тағы басқа. Зерттеушілер бруцеллездің қоздырғышының Поли-Б антигені мен сыртқы мимбрана белектарының иммуногендік қасиеті осы микофтың тұтас жасушаларына қарағанда біршама жоғары болатындығын дәлелдеп берді. Аталған антигендерді қолдана отыра, біз бруцеллалардың полисахариттердің және антигендермен қарсы МКА жасап шығаратын гибидомалардың бірнеше штамдарын алды. Осы антиденелердің көмегімен липополисахаритер мен Поли-Б антигеннің «қор» бөлігінде бруцеллалар мен Yersinia enterocolitica 09 бактериясына ортақ мульти – унивалентті детерминанталардың бар екендігі айқындалған болатын. Сонымен қатар, электрофорездің және МКА көмегімен бруцеллозалардың сыртқы мембранасының құрамында молекулалық массалары 48; 43; 25 және 14 КД тек белоктардың орналасқандығы анақталды. Бұл белоктардың агглютиногендік қасиеті бомайды. Өйткені, оларға қарсы дайындалған қан сарысуы агглютинация реакциясында бруцеллозалардың жасушаларын желімдей алмады. Алынған гибридома штаммдарының МАК – лері бурцеллезді балау әдістерін жетілдіру жұмыстарында қолданылады.
Мысалы, енжарлы гемагглютинация реакциясында МАК – лерімен тиелген эритроциттер бруцеллаларды идентификациялау жұмыстарында поливалентті қан сарысуынан дайындалған диагностикумдарға қарағанда анағұрлым тиімдірек болып шықты. БАМА және БИМА деп аталған штаммдардың МАК – лері бруцеллезге шалдыққан жануарлардан алынған материалдардағы ауру қоздырғышының антигендерін тез арада анықтай алатын иммунды фермент тәсілінде, латекс – агглютинация және енжарлы агглютинация реакцияларнда қолданылады. Айталық, практикаға ұсынылып отырған «Бруцеллезді моноклональді антиденелермен иммунды фермент тәсілінде анықтауға арналған реактивтер жиынтығы» (ТУ 10.05.4000.326-92) зерттеуге алынған патологиялық материалда, атап айтсақ, үлпершекті ақзаларда, сөл бездерінде, іш тасталған төлдердің ағзаларында бруцелла антигендерінің бар екендігін немесе жоғын 3-3,5 сағат аралығында анықтауға мүмкіндік береді.
Ал, лабораториялық жағдайда бруцеллездің қоздырғышын патматериалдан бөліп алу үшін орта есеппен алғанда 15-30 күндей уақыт қажет. Бұл диагностикум бұрынғы Кеңес Одағының халық шаруашылығы жетістіктері көрмесінің күміс медалін иемдену, Республикамыздың ветеринарлық лабораторияларында сынақтан өткен болатын.[7] Диагностикумда ИФТ –ның қатты фазасы ретінде нитроцеллюлозды қағаз қолданылады. Тетің барлық компонеттері 12 фланонда жинастырылған. Сезімталдығы өте жоғары болса да, (0,0015-0,003мкг/мл) диагностикумды кез келген лаборатория жағдайнда қолдануға болады.
1С3 және F710 деп белгіленген гибридома штаммдардыңың МКА –лері иммунды фермент тәсілінің «сэндвич» қойылымында 3-5 айлық бұзаулардың, қозылардың қан сарысуын бруцеллез ауруына зерттеу кезінде сыналды. Бірінші штаммның антиденелері бруцеллалардың малекулалық массасы 14КД болатын сыртқы мембрана белогына, екіншісі осы қоздырғыштың Поли – Б антигенінің детерминатасына қарсы бағытталған болатын. Бұл тәсіл қазіргі кезде практикада кеңінен қолданылып жүрген АР, КБР және роз бенгал сынауына қарағанда біршама сезімталдық көрсетті. Антиген ретінде ИФТ бұл қойылымында бруцелла жасушаларының дезинтеграты қолданған болатын.
Бруцеллезге шалдыққан табындардағы және отарлардағы кейбір төлдердің (5,9%-7,4) уызбен қоректенкр алдында алынған сарысуында ауру қоздырғышына үйлесімдіктік ортада өсуге антиденелер табылды. Осы төлдердің кейбіреулерінің тоңғанда бруцелла антигендердің кездесетіндігі МКА – лермен қоиылған иммунды фермент тәсілінде дәлелденді. Көңіл аударарлық мәселе – табиғи антиденелердің бруцеллез ауруына шалдыққан және осы індеттен сау табындар мен отарлардағы уыз сүт үлгермеген жаңа туған бұзаулар мен қозылардың (9-25%) сарысуда кездесетіндігі. Мұндай антиденелерді біз АР–ның микроварианттарында әсіресе, ИФТ көмегімен анықтай алады. Бұл зерттеулердің негізінде құрсақ ішінде бруцеллезге шалдыққан төлдерді анықтау тәсілі практикаға ұсынылып, оған авторлық куәлмік алынған болатын. Біз алған гибридомалардың штаммдары (БАМА, БИМА, 1С3) Санкт–Петербургтегі омыртқалы жануарлардың қоретік ортада өсуге бейімделген жасушаларының арнайы коллекциясына сақтауға алынады. Бұл гибридомалар бруцеллаларға үйлесімділігі жоғары антиденелердің арзан да тиімді көзі болмақ. Олар өндіретін МАК-лердің белсенділігі және өзіндігі коммерциялық поликлональді қан сарысуымен салыстырғанда анағұрлым жоғары.
Кейінгі кезде моноклоналды антиденелер ісік жасушасына арнайы улы заттарды жеткізу мақсатында қолданыла бастады. Ол үшін ісік жасушасына қарсы алынған моноклоналді антиденелердің вариабельді бөлінген липосоманың сыртына қаратып, мембранаға берік орналастырады. Организімге енгізген мұндай препаратқа иммундік жүйе «шабуыл»жасамайды, өйткені иммуноциттер және дене жасушалары липосома тамшылары сияқты фосфолипидтен тұратын мембырананы иемденген. Осы себебтен липосома ішіндені емдік заттар ешқандай өзгеріске ұшырамайды. Моноклональді антиденелердің вариабельді бөлігі липосоманы белгілі бір ағызаның ісік жасушаларымен байланыстырады. Жасушаларымен жалғастырылған липосомалар олардың мембранасының бір бөлігін жан-жаққа ығыстырып, өзі сол жерге мембрана болып орналасады, ал оның ішінжегі емдік заттар жасушаның ішіне еріксіз еніп кетеді.[ 5]
Қазіргі кезде қолданылып жүрген моноклоналді антиденелер тышқан жасушаларының гибридомаларынан алынған. Тышқанның антиденелері басқа жасушалардың организімі үшін антиген болып табылады. Осы себептен соңғы жылдары үй жануарларының және адам лимфоциттерінің гибридомалары алына бастады.
Моноклоналды антиденелердің негізгі қасиеттерінің бірі — олардың антигенмен байланысу беріктілігі, яғни аффинитеті. Қорыта айтқанда, гибридомдық технология әдісімен бруцеллез антигеніне телімді иммуноглобулиндердің идиотиптеріне бағытталған 2Д9 штамы IgM класына, ал 2G9 штамы IgG класына IgG2b класс тармағына жататын моноклоналды антиидиотиптік антиденелерді түзетіндігі анықталды. 2D9 және 2G9 штамдары өндіретін моноклоналды антиидиотиптік антиденелер өзінің иммунохимиялық қасиеттері жағынан барлық талаптарға сай келеді және бруцелез антигенінің «ішкі сипаты» бола алатындықтан оларды биологиялық қауіпсіз балау және дауалау препараттарын әзірлеуде қолдануға болады.
Сенсибилизацияланған планшетке асцит сұйықтығынан тазартылып алынған моноклоналды антиидиотиптік антиденелерді 0,005 мг/мл-ден бастап титрледі. Алынған реакция нәтижесі бойынша график жасалып, антигенмен байланысқан антиденелердің 50%-ның концентрациясын анықтадық. Моноклоналды антиидиотиптік антиденелердің байланысу константасы антиденелер мен антигендік детерминанталарының белсенді орталықтарының конфигурациялары бір-біріне 1×10-7M мөлшерінде сипатталды.
1 — 2G9 штамы асцитінің тазартылған препараты; 2 — 2G9 штамы өсінді сұйықтығының тазартылған препараты; 3, 4 — 2G9 және 2D9 штамдарының тазартылмаған препараты; 5 — молекулалық маркерлер (18, 24, 45, 67 кДа); 6, 7, 8 — концентірлеуге дейін хроматография фракциялары; 9 — 2D9 штамы асцитінің тазартылған препараты; 10 — 2D9 штамы өсінді сұйықтығының тазартылған препараты. Зерттеу жұмыстарында гибридомдық технология әдісімен алынған бруцеллез антигеніне телімді иммуноглобулиндердің идиотиптеріне бағытталған 2D9 және 2G9. Поли-Б және бруцеллездің стандартты антигендері қолданылды. Сонымен қатар, жұмыс барысында бруцеллезге монотелімді қоянның antiabortus және antimelitensis қан сарысулары, бруцеллезге телімді қоянның поликлоналды қан сарысуы пайдаланылды.
Зерттеу жұмыстарында иммунды ферменттік талдаудың (ИФТ) жанама қойылымы, 7% және 10%-ды полиакриламидті геліндегі электрофорезі мен 1%-ды агароза геліндегі диффузиялық преципитация реакциясы пайдаланылды. Моноклоналды антиденелердің антигенмен байланысу беріктілігі J. Beatty et al. Тәсілімен анықталды. Хроматографиялық талдау G-100 сефадексінде (құрамында 0,2М NaCl бар 0,1М трис –НСl рН 8,0 ерітіндісінде) жүргізілді.
2D9 және 2G9 гибридті жасушаштамының өсінді сұйықтығындағы моноклоналды антиидиотиптік антиденелердіңбелсенділігі мен бруцелла антигенінің«ішкі сипаты» болатындығын, бруцеллезге монотелімді қоянның поликлоналдыantiabortus және antimelitensis қан сарысулары мен бруцеллез антигеніне телімді моноклоналды антиденелердің биотинделгенFab фрагменттерін қолдану арқылы иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісіменанықталды.
Тышқандар топтарын иммунизациялау үшін қолданылған антиген түрлері. Телімді антиденелер титрі Mycobacterium tuberculosis УДД-на Mycobacterium tuberculosis ЛПС-на I M. tuberculosis УДД 1:25600 1:100 II M. tuberculosis ЛПС 1:1600 1:12800 Көрсетілген кесте деректеріне сүйенсек, Micobacterium tuberculosis ультрадыбысты дезентегратымен иммунизация жасалынған тышқандардың қан сарысуындағы спецификалық антиденелер титрі ұқсас антигендерге қарағанда иммунды ферменттік талдаудағы белсенділігі 1:25600 дейін жетті. Тышқандарды ЛПС антигенімен иммунизациялаған кезінде пайда болған антиденелер ізделіп отырған антигендермен байланысып 1:12800 титрін көрсетті. Айтылып өткен антигендеріне қарсы өңделген антиденелер арасында әлсіз қиылысқан антиденелер байқалды, бұл қолданылған препараттар детерминанттарының арасында айтарлықтай айырмашылықтардың бар екендігін дәлелдейді.
Зерттеу нәтижелері көрсеткендей, BALB/c тегіндегі тышқандарға біз қолданған Mycobacterium tuberculosis-тің УДД антигенімен және Mycobacterium tuberculosisтің липополисахаридті антигенімен иммунизациялау нұсқасы тәжірибедегі жануарлар организмінде қолданылған антигендерге қарсы жеткілікті шамадағы антиденелерді өңдеуде иммунды жүйені күшейту үшін толығымен жеткілікті болды. Бұл, тапсырылған спецификалық антиденелерді түзетін В-лимфоциттер клондарының белсенді индукциясын көрсетеді. Тышқандардың әр тобынан максималды антидене титрі бар жануарлар таңдалып алынды, олардың көкбауырлары иммунды лимфоциттер көзі ретінде пайдаланылды.
Тышқандардың лимфоциттерін X63-Ag 8.6.5.3 миеломды жасушаларымен гибридизациялау ПЭГ-4000 қатысуымен жүргізілді. Жасушалар біріккенде гибридті жасушалар (гибридом) клондары өскен ұяшықтар саны 48,7-61,5% құрады. Гибридомдарды антидене өнімдеріне тестілеуді өсетін ортаның аздаған сарғаюы байқалғанда жүргізуді бастады, гибридом жасушалары ұяшықтардың 30% беткейін алды.
Гибридті жасушалар клондарыныңең жақсы нәтижесі M.tuberculosis УДД-мен иммунизацияланған тышқандардың спленоциттерінің миеломды жасушалармен гибридизациясы кезінде байқалған. Гибридомның өсуі енгізілген 384 ұяшықтың 90 ұяшығында болған, яғни жасушалар бірігу пайызы салыстырмалы түрде жоғары (23,4%). Липополисахаридті антигендермен күшейтілген жануарлар лимфоциттерін қолданған жағдайда бұл көрсеткіш 15,6%-ға тең болған.